Вакцина против эпизоотической диареи свиней

Над свиноводческой отраслью нависла еще одна напасть, которая несет не меньшее зло, чем АЧС. Это почти аналогичная новая инфекционная проблемная болезнь — эпидемическая диарея свиней (ЭДС). Для ее профилактики, как и в случае с АЧС, нет эффективной вакцины. Поговорим об особенностях болезни, о причинах ее возникновения, о диагностике, о способах профилактики и ликвидации.

Эпидемическая (эпизоотическая) диарея свиней — острая высококонтагиозная болезнь свиней всех возрастных групп и пород, характеризующаяся диареей, рвотой и отсутствием аппетита. При заболевании ею 100 % свиней на ферме погибает 50 % животных. У инфицированных поросят первых дней жизни летальность может достигать 100 %. У отъемышей, переболевших ЭДС, в течение двух недель отмечается задержка роста. У откормочных свиней период откорма до достижения беконной массы удлиняется до 14 дней, а потеря живой массы животного к концу откорма составляет 8 кг.

По клиническим проявлениям, характеру патологоанатомических изменений и эпизоотологических особенностей ЭДС напоминает трансмиссивный гастроэнтерит (ТГС), однако вирусы, вызывающие эти болезни, оказались в антигенном отношении разными. В связи с этим ЭДС еще называют болезнью, подобной ТГС.

Историческая справка

ЭДС относится к числу сравнительно новых и малоизученных болезней. Она впервые описана в 1971 году в Великобритании и характеризуется поражением свиней всех возрастных групп. Вирусную природу заболевания установили в 1989 году. В настоящее время оно распространено во многих странах, в частности в США, Китае, Тайване, а также в государствах Европейского союза, за исключением Ирландии, Дании и Швеции. В августе 2014 года Тайвань заявил в Международное эпизоотическое бюро (МЭБ) о 12 новых вспышках ЭДС. В 2013 году в США, в штате Айова, была зарегистрирована вспышка этой болезни, вызванная очень высокопатогенным вирусом и повлекшая гибель нескольких миллионов поросят.

Этиология болезни

Возбудитель болезни относится к группе РНК-содержащих высокопатогенных коронавирусов (семейство Coronavir >

Рис. 1. Электронный снимок вируса эпидемической диареи свиней

Вирулентность вируса ЭДС варьирует, что подтверждается заболеванием свиней определенных возрастных групп. Вирус чувствителен к фенолу, дезинфектантам на основе хлора, йода, перекиси водорода. Данные об устойчивости вируса к факторам внешней среды отсутствуют.

Возбудитель инфекции

Заболевают ЭДС, как правило, свиньи всех возрастных групп. Однако при возникновении ЭДС в ранее благополучных по этой болезни хозяйствах высокая летальность (до 100 %) бывает у поросят до 5-недельного возраста, а в стационарно неблагополучных хозяйствах — среди свиней старших возрастных групп, преимущественно группы откорма. Человек и другие виды животных невосприимчивы к ЭДС.

Источником возбудителя инфекции являются больные и переболевшие вирусом ЭДС животные. В неблагополучных по ЭДС хозяйствах антиген возбудителя выявляли в 83,7 % проб фекалий от поросят с диареей. Выделение возбудителя во внешнюю среду происходит преимущественно с каловыми массами.

Возбудитель инфекции может передаваться через контаминированные вирусом ЭДС корма, особенно содержащие продукты убоя свиней, а также через сперму, воду, навоз. Кроме того, в хозяйство вирус может заноситься с закупаемыми племенными свиньями, транспортными средствами, обувью обслуживающего персонала и предметами ухода за животными.

Эпидемическая диарея свиней часто протекает в виде смешанных инфекций: в 40 % случаев был обнаружен вирус ЭДС, в 9 % — ЭДС + энтеротоксигенная кишечная палочка, в 12 % — ЭДС + эймерии.

В откормочных хозяйствах вспышки ЭДС могут возникать в течение 3–4 недель после завоза вирусоносителей, главным образом в осенне-зимний период. Вспышки заболевания обычно продолжаются 3–4 недели.

При первичном заносе высоковирулентного возбудителя в благополучное по ЭДС хозяйство заболевание протекает остро и типично, в течение 5–14 дней заболевают все свиньи. В неблагополучных по ЭДС хозяйствах, после того как свиньи переболели этой болезнью, устанавливается равновесие между уровнем колострального (молозивного) иммунитета, активного стадного иммунитета и вирусом. Заболевание в таких хозяйствах не проявляется. Однако погрешности в кормлении, отсутствие в кормах витаминов и незаменимых аминокислот, резкие колебания температуры внешней среды, нарушение микроклимата и другие стрессовые факторы могут нарушить это равновесие и спровоцировать развитие клинического заболевания, которое будет протекать в более тяжелой форме.

ЭДС регистрируется в виде энзоотии, заболеваемость составляет от 50 до 100 %, летальность — 50–100 %.

Вирус ЭДС проникает в организм преимущественно алиментарным путем и поражает эпителиальные клетки, выстилающие ворсинки тонкого и толстого кишечника (ободочной кишки). Под действием вируса ЭДС происходят дегенеративные изменения в энтероцитах, особенно тощей кишки, с последующим развитием атрофии и укорочения ворсинок и микроворсинок (рис. 2).

Рис. 2. Атрофия и укорочение ворсинок и микроворсинок в тонком и толстом отделах кишечника при ЭДС

Утрата микроворсинок уменьшает всасывающую поверхность тонкого кишечника. Это в совокупности с функциональными нарушениями и слущиванием значительного количества энтероцитов может приводить к пониженному всасыванию и развитию основного симптома — диареи. Гибель поросят наступает от ацидоза и дегидратации.

Симптомы и течение болезни

Инкубационный период у поросят моложе 1–2-недельного возраста длится 24–36 часов, у более взрослых — до 2–3 дней.

Клиническое проявление ЭДС характеризуется диареей, рвотой и отсутствием аппетита у животных всех возрастных групп. Тяжело протекает болезнь у 1–7-дневных поросят. Клинические проявления болезни у поросят этой возрастной группы могут существенно различаться в разных хозяйствах и даже в пометах одной фермы. Так, часть пометов может не поражаться, в других может иметь место лишь легкая форма диареи.

У больных ЭДС поросят отмечают рвоту с быстрым появлением после нее профузной водянистой диареи, продолжающейся 3–4 дня. Каловые массы жидкие, водянистые, зеленовато-коричневого цвета, без кровяных сгустков. Развивается сильная дегидратация организма, и гибель поросят наступает в течение 3–4 дней. Такое тяжелое протекание болезни наблюдается в пометах свиноматок, у которых во время опороса отмечалась диарея. Гибель поросят в таких пометах может достигать 50 %, а при инфицировании в первые дни жизни — до 100 %.

У поросят 7–14-дневного возраста болезнь протекает в более легкой форме. Несмотря на 100%-ную заболеваемость животных этой возрастной группы, диарея у них проявляется слабо, они остаются активными, подвижными, аппетит сохраняется. Рвота и диарея отмечаются у 20–30 % поросят.

У поросят-отъемышей и свиней на откорме отмечают диарею, продолжающуюся 4–6 дней, рвоту, угнетение, анорексию. Постоянными симптомами у взрослых свиней являются рвота и анорексия. Обычно взрослые животные, заболевшие ЭДС, выздоравливают, однако в последующем они значительно отстают в росте и развитии.

У свиноматок ЭДС сопровождается диареей, которая продолжается до 7 дней, рвотой, угнетением, анорексией; наступает их внезапная гибель. У выздоровевших свиноматок отмечают агалактию — отсутствие молока в молочной железе.

При вскрытии павших животных обнаруживают катаральный или катарально-геморрагический гастроэнтерит, некроз и изъязвление слизистой оболочки, серозное воспаление брыжеечных лимфоузлов, зернистую дистрофию печени, почек и сердца, обезвоживание, истощение и общую анемию.

При гистоисследовании находят изменения в виде дистрофии эпителия слизистой кишечника, поверхностного некроза эпителия кишечника и кишечных ворсинок.

Постановка диагноза

Для диагностики ЭДС проводят лабораторные исследования живых поросят, пораженных участков тонкого и толстого кишечника от вынужденно убитых свиней, свежих фекалий от больных животных и кусочков паренхиматозных органов.

Из лабораторных методов диагностики рекомендуется использовать ПЦР (полимеразная цепная реакция) в режиме реального времени и ИФА (метод иммуноферментного анализа) для выявления вируса ЭДС. Метод ИФА применяется также для определения антител к коронавирусу эпизоотической диареи свиней.

В сомнительных случаях рекомендуется проводить биопробу на безмолозивных поросятах путем их экспериментального орального заражения свободным от бактерий фильтратом суспензии фекалий от больных животных. Исследуются материалы, полученные от переболевших животных.

Диагноз «эпидемическая диарея свиней» считается установленным в одном из следующих случаев:

  • при выделении вируса и его идентификации;
  • при обнаружении антител в сыворотке крови в диагностических титрах;
  • при положительной биопробе.

При проведении дифференциальной диагностики следует исключить в первую очередь ТГС, ротавирусную диарею, гастроэнтеритную форму энтеровирусной инфекции и эшерихиоз. ЭДС дифференцируют также от КЧС (классическая чума свиней), лептоспироза и сальмонеллеза.

Эффективных лекарств нет

Эффективных специфических средств лечения при ЭДС нет. Для подавления секундарной бактериальной микрофлоры рекомендуется применять антибиотики, добавляя их в воду или корм. Используют неомицин, фрамицетин, апрамицин, триметоприм и др. Иногда хороший эффект получают от линкомицина или тиамулина в зависимости от присутствия вторичной условно-патогенной микрофлоры. Применяют сульфаниламидные, нитрофурановые препараты и электролиты.

Профилактика диареи

В сыворотке крови перенесших ЭДС животных обнаруживают специфические антитела в титрах от 1:40 до 1:1280. Доказано, что переболевшие ЭДС свиноматки выделяют с молозивом специфические антитела класса Ig А, что создает иммунную защиту новорожденных поросят от заболевания.

До настоящего времени эффективные средства специфической профилактики ЭДС не разработаны. Считается, что вакцины против ЭДС не будут экономически выгодными. В отдельных странах используют метод разноса фекалий от больных животных по всей ферме для быстрого создания иммунитета у остального поголовья свиней в результате их естественного переболевания. Переболевшие свиноматки обеспечат колостральную (молозивную) иммунную защиту самой уязвимой возрастной группы поросят — до 5-недельного возраста.

Быстрое распространение ЭДС во многих государствах мира указывает на возможное разнообразие трансграничной передачи возбудителя этой болезни через вирусоносители: корма, транспорт, объекты внешней среды, продукты убоя свиней, контаминированные возбудителем, и т. д.

В связи с этим главный способ профилактики ЭДС — не допускать попадания на территорию страны возбудителя этой болезни. Поэтому импортировать свиней, продукты убоя и сперму животных, а также корма следует только из благополучных по ЭДС государств (территорий). С целью предупреждения ЭДС отдельные страны (Ирландия, Дания) не допускают серопозитивных свиней на свою территорию.

В основу профилактики ЭДС в Беларуси должны быть положены: соответствующий серомониторинг импортированных в республику свиней и спермы; ограничение ввоза кормов и продуктов убоя свиней из неблагополучных по этой болезни государств (территорий); комплексная биозащита ферм и комплексов при соблюдении принципа «все пусто — все занято»; строгое соблюдение технологии выращивания и требований к кормлению свиней различных возрастных групп; другие профилактические мероприятия — дезинфекция помещений, в том числе аэрозольная, а также дератизация и дезинсекция.

источник

Сергеев О.В. НИИ вирусологии им. Ивановского, г. Москва
Кочетков П.С. ООО «Ветбиохим», г. Москва
Сербис Е.С. ВНИИиТИ биологической промышленности, г. Москва

Для специфической профилактики эпизоотической диареи свиней (ЭДС) применяют как живые, так и инактивированные вакцины. Показано, что живые вакцины против данного заболевания обладают большей эффективностью, чем инактивированные [4, 5]. Ранее нами была разработана живая вакцина ИС-ЭДС, которую изготовляют из штамма ИС вируса ЭДС, адаптированного к размножению в культуре клеток Vero [2, 3]. Эффективность данной вакцины была показана при массовой вакцинации свиней в ряде хозяйств [4].

При производстве живых вакцин существует необходимость изготовления сухих вакцинных препаратов для длительного хранения и транспортировки. Целью данной работы является разработка способа производственного изготовления и хранения сухой вакцины ИС-ЭДС, обеспечивающего максимальную сохранность вакцинного вируса. Для этого были поставлены задачи: подбор наиболее эффективной для данного вируса стабилизирующей среды, выбор режима замораживания — высушивания и оценка стабильности сухой вакцины.

Вирус. Вакцинный штамм ИС вируса ЭДС использовали в виде культуральной суспензии. Вирус выращивали в культуре клеток Vero, как описано ранее [2, 3].

Инфекционную активность штамма ИС вируса ЭДС проверяли титрованием в культуре клеток Vero. Титрование сухой вакцины проводили после регидратации культуральной средой ДМЕМ. Затем готовили серийные десятикратные разведения вируса в бессывороточной среде ДМЕМ, содержащей 5-10 мкг/мл трипсина.

Для титрования вируса использовали культуру клеток со сплошным монослоем в 96-луночных пластиковых планшетах, предварительно отмытые от ростовой среды. Каждое разведение вируса вносят по 0,1 мл в 4 лунки. 4 лунки незаражённой культуры оставляют в качестве контроля. Планшеты с заражённой и контрольной культурами помещают в СО2-инкубатор при (37+0,5)0С. Результаты титрования учитывают по ЦПЭ на 2-4 сутки. Титр вируса определяют по методу Рида и Менча и выражают в тканевых цитопатических дозах, вызвавших дегенерацию 50% заражённых культур, в 1 мл (ТЦД5(/мл).

Стабилизирующие среды. С целью уменьшения потери активности в результате сушки вирусную суспензию смешивали с одной из трёх стабилизирующих (защитных) сред, использованных в работе: декстраново-желатиновой, пептонно-желатозной и молоком.

Декстраново-желатиновая среда состоит из следующих ингредиентов (в граммах на 1 л бидистиллированной воды): декстран 50, желатин 30, гидролизат казеина 20, сахароза30, сорбит 50, гидрофосфат калия 1,25, дигидрофосфат калия 0,5. Растворяли примерно в 2/3 конечного объёма воды. После доведения рН до 7,3-7,4 2М гидроксидом калия добавляли воду до конечного объёма и автокла-вировали при 121-1250С в течение 30 мин.

Пептонно-желатозную среду готовили и применяли, как описано ранее [1].

Молоко готовили альтернативно двумя способами. 1) Сухое обезжиренное молоко стерилизовали гамма-облучением интенсивностью 2 млн рад. Растворяли в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7,3-7,4) в весовой пропорции 1:6, затем центрифугировали суспензию в 50-мл центрифужных пробирках при 5 000 об/мин в течение 10 мин. 2) Коммерческое пастеризованное молоко 2,5 или 3,2 % жирности стерильно разливали в 50-мл центрифужные пробирки, однократно замораживали-оттаивали, затем центрифугировали суспензию в 50-мл центрифужных пробирках при 5 000 об/мин в течение 10 мин. После проверки рН (7,2-7,4) супер-натант сливали и смешивали с вирусной суспензией или хранили в замороженном виде.

Вирусную суспензию смешивали с декстраново-желатиновой средой в отношении 0,7 : 0,3, с пептонно-желатозной средой или молоком — в отношении 1 : 1.

Сублимационная сушка вакцины ИС-ЭДС. Смесь культурального вируса со стабилизирующей средой расфасовывали вручную (малые объёмы) или на автоматической линии по 1 мл во флаконы объёмом 3 см3, устанавливали на каждый флакон резиновую пробку с пазами для удаления влаги.

Для сушки в лабораторной установке Christ Alpha расфасованную вакцину предварительно замораживали в холодильнике при -600 — -70 0С в течение 16 ч, затем помещали в сушильную установку. Объем партий для сушки составлял 80-100 флаконов.

При производственной сушке расфасованную вакцину замораживали в установке Christ Epsilon перед началом сублимации. Сразу после расфасовки в один или два флакона с вакциной помещали датчики температуры. Замораживание проводили в течение 6-8 ч до достижения в материале температуры полного замораживания, — 500С или ниже. Объём производственных партий составлял 1,2 — 20 тысяч флаконов.

Сублимацию проводили при значениях вакуума в камере около 0,16 мБар в течение не менее 50 ч. После удаления из препарата около 90% влаги проводили досушивание при температуре 30-350С в течение 15 ч.

По окончании сублимационной сушки флаконы герметично укупоривали непосредственно в камере сублиматора с помощью прижимных плит, после чего камеру заполняли атмосферным воздухом. После определения вакуума и остаточной влажности флаконы с сухой вакциной закатывали алюминиевыми колпачками.

Определение вакуума в сухой вакцине. Вакцина считается пригодной для практического применения только при наличии вакуума во флаконах. Поэтому все флаконы сухой вакцины проверяли на наличие вакуума с помощью аппарата Д’Арсонваля. Наличие светящегося разряда во флаконах свидетельствует о наличии вакуума.

Определение массовой доли влаги в сухой вакцине. Определяли уменьшение массы сухой вакцины после досушивания её по ГОСТ N° 24061 — 89 (СТ СЭВ 6279 — 89). Массовая доля влаги в сухой вакцине должна быть в пределах 1-4%.

«Ускоренное старение» вакцины. 6 флаконов с сухой вакциной выдерживали в течение 7 суток при 370С. По истечении этого срока определяли активность вируса в усреднённой пробе.

Сублимационную сушку в аппарате Christ Alpha проводили для сравнения протективного эффекта трёх стабилизирующих сред в отношении биологической активности вакцинного штамма ИС вируса ЭДС.

Результаты исследования приведены в Таблице 1. Из представленных данных видно, что активность вируса ЭДС снижается ещё на стадиях добавления стабилизирующей среды и последующего замораживания. Потеря активности вируса, смешанного с декстраново-желатиновой средой, составляла 0,00 — 0,24 lg ТЦД50 / мл после замораживания; вируса, смешанного с пептонно-желатозной средой, — 0,33 — 0,50 lg ТЦД50 / мл и вируса, смешанного с молоком, — 0,00 — 0,34 lg ТЦД50 / мл.

Таблица 1. Активность вируса ЭДС при сушке с тремя стабилизаторами

Активность вируса ЭДС, lg ТЦД50 / мл

Смесь вирус + стабилизатор

После ускоренного старения

В результате сушки вирус терял 0,50 — 0,84 lg ТЦД50 / мл в препаратах с первой или второй средой и 0,66 — 0,84 lg ТЦД50 / мл в препаратах с молоком. Таким образом, суммарное снижение активности вируса, по сравнению с исходной куль-туральной суспензией, составило 0,66 — 0,84 lg ТЦД50 / мл при использовании декстраново-желатиновой среды, 1,00 — 1,24 lg ТЦД50 / мл при использовании желатозно-пептонной среды и 0,84 — 1,00 lg ТЦД50 / мл при использовании обезжиренного молока.

Для оценки стабильности вакцинных препаратов при длительном хранении в будущем проводили их испытание методом «ускоренного старения». В ходе ускоренного старения активность вируса снижалась на 1,00 lg ТЦД50 / мл в препаратах с декстраново-желатиновой средой, на 1,43 — 1,53 lg ТЦД50 / мл в препаратах с пептонно-же-латозной средой и на 1,33 — 1,66 lg ТЦД50 / мл в препаратах с обезжиренным молоком.

Дополнительно была проведена сушка вирусной культуральной суспензии с консервированным концентрированным молоком (без предварительного обезжиривания), рН 7,2-7,4. Использовали культуральную суспензию с активностью вируса ЭДС 5,5 lg ТЦД50/мл. Вирусную суспензию смешивали с концентрированным молоком в отношениях 1:1, 2:1 и 4:1. Образцы сушили в сублиматоре Christ alpha. В качестве контроля одновременно сушили смеси вируса с декстраново-желатинным и пептонно-желатоз-ным стабилизаторами в соответственных пропорциях.

Результаты приведены в Таблице 2. Из результатов видно, что концентрированное необез-жиренное молоко как защитная среда менее пригодна по сравнению с обезжиренным молоком. Увеличение концентрации молока в смеси не привело к улучшению сохранности вируса в сухом препарате.

Таблица 2. Активность вируса ЭДС при сушке с молоком в различных пропорциях

Пропорция молоко : вирусная суспензия

Активность вируса ЭДС, lg ТЦД50 / мл

Смесь вирус + стабилизатор

После ускоренного старения

Таблица 3. Активность вируса в экспериментальных сериях сухой вакцины ИС-ЭДС

Активность вируса, lg ТЦД50 / мл

Смесь вирус + стабилизатор

Приведённые результаты согласуются с результатами, приведёнными в Таблице 1. В результате смешивания со стабилизирующей средой активность вируса снижалась на 0,00 — 0,16 lg ТЦД50 / мл, в результате сушки — на 0,50 — 0,84 lg ТЦД50 / мл, что дало суммарное снижение активности вируса по сравнению с исходной культу-ральной суспензией на 0,50 — 1,00 lg ТЦД50 / мл. В результате ускоренного старения — на 1,00 — 1,23 lg ТЦД50 / мл.

Данные, приведённые в таблицах 1-3, показывают, что наиболее эффективной из испытанных стабилизирующих сред является декстраново-желатиновая. Кроме того, препараты, содержащие данную среду, наиболее эффективно растворялись при регидрации. Декстраново-жела-тиновую среду использовали в дальнейших экспериментах и для изготовления производственных серий сухой вакцины ИС-ЭДС.

Читайте также:  Рисовый отвар при диарее рецепты

Производственная сушка. За 2010-2011 были изготовлены восемь серий сухой вакцины ИС-ЭДС. Cублимацию проводили в аппарате Christ Epsilon. Использовали вирус, прошедший 80 — 100 пассажей в культуре клеток Vero, с титром активности в исходной культуральной суспензии 5,50 — 6,00 lg ТЦД50 / мл. После определения активности вируса в сухой вакцине рассчитывали число прививочных доз вакцины в фасовке (объём сушки 1 мл), исходя из значения 4,00 lg Т1_1Д50, установленного для одной прививочной дозы вакцины [2].

Результаты приведены в Таблице 4. Из данных, представленных в таблице, видно, что с увеличением объёма смеси, проходящей сушку, вирус ЭДС теряет больше активности в результате сушки. При объёме 1,2 — 2,3 л (серии 1-3) потеря активности составляла 0,66 lg ТЦД50 / мл, что соответствует потере активности при лиофилизации в аппарате Christ Alpha (Табл. 1 и 3). При объёме компоновки 12 — 20 л (серии 4-8) потеря активности была 0,83 — 1,00 lg ТЦД50 / мл.

Таблица 4. Активность вируса в производственных сериях сухой вакцины ИС-ЭДС

Активность вируса, lg ТЦД50 / мл

Число прививочных доз в 1 мл

Хранение вакцины. Для определения срока годности вакцины образцы всех её серий помещали на хранение при +2 — +60С в течение различного срока: 3, 6, 9 и 12 месяцев. По окончании каждого срока хранения определяли активность вируса ЭДС в соответствующих образцах. Все серии вакцины также были испытаны в режиме ускоренного старения.

Результаты исследования приведены в Таблицах 5 и 6. Каждые три месяца хранения сопровождались потерей активности вируса на 0,00 — 0,33 lg ТЦД50 / мл, за один год хранения активность вируса снижалась на 0,50 — 0,83 lg ТЦД50 / мл. После хранения в режиме ускоренного старения, активность вируса в образцах вакцины снижалась на 0,67 — 1,17 lg ТЦД50 / мл (в большинстве случаев на 1,00 lg ТЦД50 / мл).

Таблица 5. Активность вируса в экспериментальных сериях вакцины ИС-ЭДС в процессе хранения при +2 +60С

Активность вируса, lg ТЦД50 / мл

После ускоренного старения

Таблица 6. Активность вируса в производственных сериях вакцины ИС-ЭДС в процессе хранения при +2 +60С

Активность вируса, lg ТЦД50 / мл

После ускоренного старения

В нашей работе были исследованы четыре вида стабилизирующих сред: молоко (концентрированное и обезжиренное), декстрано-вая и пептонно-желатозная. Максимальное сохранение биологической активности штамма ИС вируса ЭДС в сухом препарате является особенно важным, так как вирус в культуре клеток накапливается в относительно низком титре (105,5 — 106,5 ТЦД50/мл). В результате проведенных исследований было найдено, что декстрановая среда обеспечивает наилучшую сохранность активности вакцинного вируса из испытанных сред.

С использованием декстрановой стабилизирующей среды были изготовлены лабораторные, лабораторно-производственные и производственные серии вакцины с использованием различных сублимационных установок. Анализ изменения биологической активности вакцинного вируса показал, что в результате сушки вирус теряет 1,00

— 1,50 lg ТЦД50 / мл активности. Потеря активности не зависела от типа установки, но была несколько больше при увеличении объёма культуральной суспензии для сушки. Возможно, что различие активности вируса ЭДС в вакцине, высушенной на разном оборудовании, была связана с технологией замораживания. При сушке в лабораторном сублиматоре, замораживание проводили в холодильнике, при сушке в производственном сублиматоре материал замораживали непосредственно на плитах. Выявление зависимости активности сухого вируса от скорости замораживания и, следовательно, структуры сухой таблетки представляется актуальным и составляет предмет дальнейших исследований.

Изучение стабильности сухой вакцины ИС-ЭДС при испытании в режиме ускоренного старения в сравнении с её сохранностью при +2-+60С в течение 12 месяцев показало ценность данного метода для предварительной оценки будущей стабильности вакцины при длительном хранении. Так, испытание 16 серий сухой вакцины методом ускоренного старения показало снижение титра инфекционности на 0,67-1,17 lg ТЦД50 / мл (в среднем на 1,00 lg), тогда как те же серии вакцины через 12 месяцев хранения при +2-+60С снижали активность на 0,50-0,83 lg ТЦД50 / мл (в среднем на 0,70 lg). Из результатов этого исследования можно сделать следующее заключение: если при ускоренном старении сухой вакцины ИС-ЭДС биологическая активность вакцинного штамма ИС вируса ЭДС снижается на 1,00 lg ТЦД50 / мл, можно с большой долей вероятности сказать, что при хранении в течение 12 месяцев при +2-+60С его активность снизится не больше, чем на 0,83 lg ТЦД50 / мл. Таким образом, метод ускоренного старения представляет интерес как экспресс метод оценки качества сухих препаратов, а также новых стабилизаторов и режимов сублимации.

Список литературы

  1. Дмитренко В.В., Закутский Н.И., Балышева В.И. Вирусвакцина против КЧС из штамма «ЛК-ВНИИВВиМ». //Свиноводство. 2011, N°8, С.44-46.
  2. Сергеев О. В., Алипер Т.И., Мухин А.Н., Сергеев В.А. Испытание аттенуированного штамма вируса эпизоотической диареи свиней в экспериментальных условиях. //Ветеринария. 2010, N°1, C. 21-25.
  3. Сергеев О. В., Алипер Т.И., Сергеев В.А. Использование аттенуиро-ванного штамма ИС вируса эпизоотической диареи свиней для изготовления живой вакцины. //Ветеринария. 2010, N°10, C. 22-25.
  4. Сергеев О.В. с соавт. Применение живой вакцины против эпизоотической диареи свиней в производственных условиях. //Ветеринария. 2011, N°6, C. 8-11.
  5. Song D.S., Oh J.S., Kang B.K. et al. Oral efficacy of Vero cell adapted porcine epidemic diarrhea virus DR13 strain. // Res. Vet. Sci. 2007, Vol.82, P.134- 140.

Живую вакцину против эпизоотической диареи свиней (ЭДС) сушили в сублимационной установке с целью длительного хранения. Сухую вакцину готовили с одной из трёх защитных сред: декстрановой, желатозно-пептонной и молоком. Сохранность активности вируса ЭДС в сухих препаратах при хранении оценивали методом «ускоренного старения». Из испытанных защитных сред декстрановая оказалась наиболее эффективной. В процессе сушки вакцины с декстрановой средой активность вируса снижалась на 0,66 — 0,84 lg ТЦД5С/мл в одной сушильной установке и на 0,84 — 1,00 lg ТЦД50/мл в другой. Авторы предполагают, что некоторое различие активности вируса ЭДС в вакцине, высушенной на разном оборудовании, была связана с технологией замораживания: перед сушкой (быстрая) или в сушильной камере (постепенная). При хранении при 2 — 60С в течение 12 мес активность вируса снижалась на 0,50 — 0,84 lg ТЦД50/мл, тогда как в результате ускоренного старения потеря активности в среднем была 1,00 lg ТЦД50/мл. Таким образом, метод ускоренного старения представляет интерес как экспресс метод оценки качества сухих препаратов, а также новых стабилизаторов и режимов сублимации.

Ключевые слова: Эпизоотическая диарея свиней (ЭДС), вирус, цито-патическая активность, живая вакцина, стабилизирующая среда, заморозка, сублимация, сушка, сухой препарат, ускоренное старение.

Павел Сергеевич Кочетков, инженер, ООО «ВЕТБИОХИМ»,123098, Москва, ул. Гамалеи 16, Моб. Тел. (926) 682-68-87, e-mail: Kochetkovps@mail.ru.

Елена Сергеевна Сербис, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, ВНИиТИ биологической промышленности, 141142, Московская обл., Щелковский р-н, пос. Биокомбината, моб. тел. (915) 055-75-60, e-mail: eserbis@mail.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Олег Витальевич Сергеев, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, 123098, Москва, ул. Гамалеи 16, Моб. Тел. (926) 792-70-74, e-mail: osergeyev123@gmail.com .

PRODUCTION OF DRY LIVE VACCINE AGAINST PORCINE EPIzOOTIC DIARRHEA

Sergeyev O.V., Kochetkov P.S., Serbis E.S.

Live vaccine against porcine epizootic diarrhea is freeze-dried for long term storage. Dry vaccine is made with one of three protective mediums dextran, gelatin-peptone and milk. Safety of viral activity in dry preparations during storage was assessed by the method of «accelerated aging». Dextran was the most effective of the teste stabilizing medium, thus it was used for commercial vaccine manufacturing.

Thus, method of accelerated aging is of interest as rapid method of assessing quality of dry products as well as new of stabilizers and modes of sublimation.

Key words: porcine epizootic diarrhea, virus, cytopathic activity, live vaccine, stabilizing medium, freeze-drying, sublimation, drying, dry preparation, accelerated ageing.

источник

В.А.СЕРГЕЕВ, профессор, доктор биологических наук, О.В.СЕРГЕЕВ, кандидат биологических наук, НИИ вирусологи им. Д.И.Ивановского

В 1971 в Англии среди откормочных свиней и подсосных поросят наблюдали неизвестные до того острые вспышки диареи. Клинические проявления заболевания были схожи с трансмиссивным гастроэнтеритом (ТГС) кроме той важной разницы, что у подсосных поросят не наблюдали рвоту [2, 38]. Вирус ТГС и другие известные энтеропатогенные агенты были исключены. Аналогичное заболевание, наблюдавшееся в других Европейских странах, получило название «эпизоотическая вирусная диарея» (EVD).

В 1978 была установлена связь наблюдаемых вспышек с корона-подобным вирусом [6, 40]. Экспериментальное заражение прототипным штаммом CV777, вызвало диарею у поросят и свиней на откорме [9]. Возбудитель болезни получил название «вирус эпизоотической диареи свиней» (PEDV) [39].

Вирус ЭДС на основе антигенных и генетических критериев относят к группе 1 рода Сoronavirus семейства Сoronaviridae вместе с вирусом ТГС, коронавирусами кошек, собак и человека 229Е. Геном прототипного штамма СV777 имеет размер 28033 нуклеотидов [1, 17, 30, 50]. Подобно другим коронавирусам, вирус ЭДС содержит 3 белка: негликолизированный белок N (57-58 кД), который вместе с геномной РНК формирует нуклеокапсид вируса; трансмембранный гликопротеин М (27-32 кД) и пепломерный гликопротеин S (180-200 кД) [11; 16; 50].

Нет доказательства существования более одного серотипа вируса ЭДС.

Прототипный штамм CV777 по нуклеотидной последовательности гена N гомологичен корейским и японским изолятам более чем на 90% [31,37,53].

Частицы вируса ЭДС по морфологии и морфогенезу обладают всеми характеристиками семейства Coronaviridae [6, 40]. Средний диаметр 130 нм (95-190 нм). Булавовидные пепломеры (шипы) имеют длину 18-23 нм и располагаются радиально от сердцевины, формируя «корону». Сборка частиц происходит путём почкования через внутренние цитоплазматические мембраны [13, 48].

Вирус ЭДС является чувствительным к эфиру и хлороформу. Его плотность в градиенте сахарозы равна 1,18 г/см 3 . Вирус, адаптированный к культуре клеток, теряет инфекционность при >60°С в течение 30 мин., но сохраняет стабильность при 50°С. При 4°С вирус стабилен при рН 4,0-9,0, при 37°С он стабилен при рН 6,5-7,5. Вирус ЭДС не обладает гемагглютинирующей активностью [36].

Многие типы культур клеток были безуспешно использованы для культивирования вируса ЭДС. Впоследствии было найдено, что культура клеток Vero (почка зелёной мартышки) поддерживает серийное размножение вируса ЭДС. В культуре клеток Vero вирус был выделен из тонкого кишечника как естественно больных, так и экспериментально инфицированных поросят. Полевые изоляты вируса проходили до 100 серийных пассажей в клетках Vero. Поддерживающая среда в период размножения вируса содержала трипсин в концентрации 1-2 мкг/мл. Размножение вируса сопровождается выраженным цитопатическим эффектом (ЦПЭ), который выражается в вакуолизации клеток и формировании синцития (симпласты, содержащие до 100 ядер). При выделении вируса из фекалий больных поросят несколько «слепых» пассажей требовалось провести перед появлением ЦПЭ в клетках Vero [19, 32, 33, 36, 43, 47].

При серийном пассировании вирус (10 5,0 ТЦД50/мл) вносили в культуру клеток через 48 часов после посева клеток, когда монослой ещё полностью не сформировался. После развития выраженного ЦПЭ, вирус выделяли из клеток путём повторного замораживания-оттаивания [19, 23]. Титр вируса достигал пика (около 10 5,5 БОЕ/мл) через 15 часов после инокуляции [19, 36]. Изолят KPEDV-9 на 90 пассаже достиг титра 10 6,5 ТЦД50/мл [33], a изолят DR13 на 55 пассаже достиг уровня 10 6,0 ТЦД50/мл и до 100 пассажа накапливался в пределах 10 6,5 – 10 7,0 ТЦД50/мл [47].

Вирус ЭДС, длительно адаптированный к клеткам Vero успешно размножался в культурах клеток как свиного, так и несвиного происхождения: МА 104, CPK и ESK в присутствии трипсина [32]. В линиях клеток свиньи KSEK-6 и IBRS-2 изолят P-5V серийно размножался даже без добавления трипсина [23], хотя роль трипсина в повышении уровня репродукции вируса ЭДС была показана экспериментально [7].

Имеются сведения о выделении вируса ЭДС в культурах клеток мочевого пузыря и почки свиньи, выращенных в плашках, покрытых коллагеном, в присутствии трипсина в поддерживающей среде [43].

В 1982 — 1990 годах антитела к ВЭДС были обнаружены у свиней во многих странах Европы и Азии. Сообщения о наличии вируса ЭДС в Северной и Южной Америке отсутствуют [41]. В Европе вспышки ЭДС регистрировали редко, тогда как в Азии часто происходят массовые вспышки ЭДС, сопровождающиеся высокой смертностью поросят. По массовости, остроте и суровости течения их нельзя клинически отличить от типичных острых вспышек ТГС.

Фекально-оральный путь является главным, если не единственным, путём передачи вируса ЭДС. Острые вспышки инфекции в восприимчивых хозяйствах часто происходят через 4-5 дней после продажи или покупки свиней. Вирус ЭДС не отличается от вируса ТГС в отношении способов передачи, но похоже, что первый легче вызывает персистентную инфекцию в хозяйстве после окончания острой вспышки[41].

Главным и часто единственным клиническим признаком ЭДС является водянистая диарея. Вспышки могут значительно варьировать по заболеваемости и летальности. На некоторых фермах заболевают свиньи всех возрастов, и заболеваемость приближается к 100%. ЭДС очень сходна с ТГС за исключением более медленного распространения и несколько более низкой смертности новорождённых поросят. Поросята в возрасте до 1 недели могут погибнуть от дегидрации после 3-4-дневной диареи. Средняя смертность поросят обычно составляет 50%, но может достигать 100%. Взрослые свиньи выздоравливают примерно через 1 неделю. После острой вспышки диарея у поросят может наблюдаться в течение 2-3 недель после отъёма. В последние годы типичные острые вспышки с высокой смертностью новорождённых поросят в Европе наблюдают редко, но они часто происходят в Корее [5] и Японии [48].

При острой вспышке ЭДС в хозяйстве все откормочные свиньи заболевают с развитием диареи в течение недели. У животных отмечают частичную потерю аппетита, депрессию и водянистую диарею. К концу откормочного периода ЭДС часто протекает тяжелее, чем ТГС. Животные проявляют большую болезненность в области живота и, как правило, выздоравливают через 7-10 дней. Смертность составляла 1-3%, обычно на ранней стадии диареи или даже до проявления диареи. При некропсии у таких животных обнаруживают острый некроз спинной мускулатуры. Наиболее высокая смертность наблюдается у свиней, чувствительных к стрессу. По сравнению с ТГС ЭДС распространяется медленнее. Распространение вируса из одного свинарника в другой может занять 4-6 недель, некоторые свинарники, не имеющие контакта между собой, могут оставаться свободными от инфекции.

Вирус размножался в цитоплазме эпителиальных клеток ворсинок тонкой и ободочной кишок, что было показано иммунофлуоресценцией и электронной микроскопией. Инфицированные эпителиальные клетки обнаруживали уже через 12-18 часов, а их максимальное количество наблюдали через 24-36 часов после заражения. Репликация вируса в тонком кишечнике приводила к разрушению эпителиальных клеток и укорочению ворсинок. Отношение высоты ворсинок к глубине крипт уменьшается до 3:1 по сравнению с нормой 7:1. Дегенерацию инфицированных клеток эпителия ободочной кишки не наблюдали [41].

Трехдневные поросята, заражённые орально прототипным штаммом СV777 вируса ЭДС, заболевали через 22-36 часов после инокуляции. Изменения в тонком кишечнике у поросят при ЭДС подобны изменениям при ТГС. Однако репликация вируса и развитие инфекционного процесса при ЭДС протекают медленнее, чем при ТГС [9,10].

Репликация вируса ЭДС y поросят была обнаружена только в кишечном тракте. Shibata et al. [43] показали, что свиньи в возрасте 2 дней – 12 недель, заражённые полевым вирусом ЭДС, проявляли устойчивость к заражению в зависимости от возраста. Погибали только 2-7-дневные поросята.

Клинические признаки ЭДС, описанные в Корее и Японии, идентичны тем, которые наблюдали в Европе, за исключением того, что нет доказательств репликации азиатских штаммов вируса в ободочной кишке [26, 48] и не было случаев внезапной смерти откормочных животных.

Патанатомические изменения выражаются повреждением только тонкого кишечника, который заполняется и растягивается жёлтой жидкостью [14, 15, 48]. Вакуолизация и слущивание энтероцитов ворсинок тонкого кишечника начинаются через 24 часа после заражения и совпадают с началом диареи. Инфицированные ворсинки быстро укорачиваются и их энзиматическая активность резко снижается. Морфологические изменения ворсинок подтверждены сканирующей ЭМ [12], которая показала большое сходство изменений при ЭДС и ТГС. Гистопатологические изменения в ободочной кишке не были выявлены.

Формирование вирионов в основном происходит внутри клеток и завершается путём почкования через мембраны эндоплазматического ретикулума (ЭПР) [13, 21]. В ободочной кишке наблюдали лишь некоторые изменения в энтероцитах. Они содержали вирусные частицы, но не подвергались слущиванию.

Диагноз на ЭДС нельзя поставить только на основании клинических признаков. Острые вспышки ЭДС у свиней всех возрастов нельзя клинически отличить от таковых при ТГС. Этиологический диагноз можно установить на основе обнаружения вируса ЭДС, или его антигена, или специфических антител. Наиболее чувствительными, быстрыми и надёжными методами являются прямая иммунофлуоресценция (ИФ) [19, 43] и иммуногистохимия срезов тонкого кишечника новорожденных поросят [18, 48]. Однако эти исследования можно проводить только на поросятах, убитых во время острой фазы диареи, предпочтительно в течение первых 2 дней после начала болезни. Данные методы также часто ненадёжны при исследовании кишечника свиней, погибающих естественно в результате резкого нарушения пищеварения.

Частицы вируса ЭДС можно обнаружить в фекалиях методом прямой электронной микроскопии (ЭМ), хотя их выявить нелегко, особенно если пепломерная «корона» вириона утрачена или видна нечётко. Количество позитивных фекальных образцов, полученных от экспериментально заражённых поросят в первый день диареи, по данным ЭМ, максимально составляло 73%. Для того, чтобы различить вирусы ЭДС и ТГС, имеющих одинаковую морфологию, требуется иммуноэлектронная микроскопия.

Для выявления антигенов вируса ЭДС в фекалиях, а также для демонстрации специфических антител в сыворотке крови был создан ряд наборов иммуноферментного анализа (ИФA). Они чувствительны и надёжны для постановки диагноза, особенно группового. Для антигенных версий ИФA использовали поли- и моноклональные антитела и вирус, размноженный в организме поросят [2, 3, 51].

Для антительного ИФA антигеном является полуочищенный вирус, размноженный либо в организме животных, либо в культуре клеток [2, 4, 33], или вирусные белки S и N, выделенные из инфицированных клеток Vero [29]. Антитела также обнаруживали в молоке свиноматок методом ИФА [8].

Другие диагностические тесты на обнаружение вируса ЭДС в фекалиях включают обратную транскрипцию – полимеразную цепную реакцию (RT-PCR) [22, 25]. RT-PCR была разработана для дифференциальной диагностики вирусов ЭДС и ТГС в образцах кишечника и фекалий больных свиней [27, 28].

Читайте также:  Диарея при остром нефрите

Специфические антитела к вирусу ЭДС можно обнаружить в сыворотке крови свиней после естественного или экспериментального заражения, используя ИФA, блокирующий ИФA, непрямую ИФ и нейтрализацию вируса ЭДС в культуре клеток Vero [2, 20, 41, 43]. Сыворотки крови инфицированных свиней следует получать не раньше 2 недель после начала диареи.

Так как ЭДС не распространяется очень быстро, можно применять общесанитарные превентивные меры и на время задержать проникновение вируса в репродукторные свинарники с опоросами и новорождёнными поросятами. Задержка естественного заражения поросят до достижения более старшего возраста может значительно уменьшить заболеваемость и гибель свиней. Вместе с тем по аналогии с ТГС ранний контакт супоросных свиноматок с инфицированными вирусом ЭДС фекалиями или скармливание суспензии кишечника больных поросят стимулирует лактогенный иммунитет и сокращает вспышку ЭДС в хозяйстве. Если вирус циркулирует в последовательных помётах подсосных поросят, можно попытаться прекратить его перманентную передачу путём перемещения свиней сразу после окончания подсосного периода в другое место не менее, чем на 4 недели. Одновременно с этим поступление новых животных в хозяйство должно быть временно прекращено.

B Азии, в отличие от Европы, вспышки ЭДС оказались настолько суровыми, что возникла потребность создания вакцины против ЭДС. Возможным путём создания вакцины является аттенуация вируса длительным пассированием в культуре клеток. Cерийное пассирование приводит к снижению патогенности вируса для новорожденных поросят и свиноматок, но сохраняет его способность вызывать протективный иммунный ответ у привитых свиней [34, 47].

Аттенуированный штамм KPEDV-9 на 93 пассаже в культуре клеток Vero был использован для орального и внутримышечного введения безмолозивным поросятам в возрасте 1-4 дня. Из 8 поросят, получивших 10 мл суспензии вируса в концентрации 10 8 ТЦД50/мл перорально, только 3 развили мягкую диарею. Все поросята, привитые вирусом в дозах 10 6 и 10 7 ТЦД50/мл, не показали каких-либо признаков инфекции [34]. Штамм DR13 на 100 пассаже в клетках Vero не вызвал диарею, анорексию и виремию у новорождённых поросят и беременных свиноматок. Только 1 из 14 поросят проявлял слабую диарею [47]. Эти данные были подтверждены в последующих экспериментах [44, 45].

Супоросные свиноматки, привитые внутримышечно аттенуированным штаммом KPEDV-9 в дозе 10 7 ТЦД50, развили высокие титры противовирусных антител в крови и молозиве, которые легко выявляли в ИФА. Новорождённых поросят, родившихся от вакцинированных свиноматок, заражали перорально полевым вирулентным вирусом ЭДС в дозах 10 и 5 ЛД 50 и наблюдали в течение 2 недель. При 10 ЛД50 смертность была 20% по сравнению со 100% в контрольной группе, при 5 ЛД50 все иммунные поросята выжили по сравнению с гибелью 60% контрольных поросят [34]. Аналогичные результаты были получены в опытах со штаммом DR13, аттенуированным подобным способом [47]. Было также показано, что оральное введение аттенуированного DR13 приводит к более выраженному иммунитету у свиноматок и лучшей защите потомства от инфекции по сравнению с внутримышечным введением [46]. Однако эффективность применения аттенуированных штаммов в полевых условиях предстоит установить.

В Японии с 1997 для профилактики свиноматок применяют коммерческую живую вакцину из штамма Р-5V, аттенуированного в культуре клеток. Вакцина считается эффективной, хотя не все свиноматки развивают выраженный лактогенный иммунитет [49].

Известны опыты пассивной защиты поросят иммуноглобулинами несвиного происхождения. Оральное введение новорождённым поросятам желтка куриных яиц или коровьего молозива, содержащих иммуноглобулины к вирусу ЭДС, оказывало иммунопрофилактический эффект, предотвращая болезнь или уменьшая смертность [35, 42].

Представляет также интерес получение антигена вируса ЭДС в трансгенных растениях. Синтез рекомбинантного гликопротеина S вируса в трансгенном табаке составил 2,1% от общего растворимого белка, что делает это растение потенциальным объектом для создания «кормовой вакцины» [24].

источник

Разработка и испытание живой сухой вакцины против эпизоотической диареи свиней (вакцина ВЕРРЕС-ЭДС) в экспериментальных и производственных условиях Сергеев Олег Витальевич

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ‘, MOUSEOFF, FGCOLOR, ‘#FFFFCC’,BGCOLOR, ‘#393939’);» onMouseOut=»return nd();»> Диссертация — 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат — бесплатно , доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Сергеев Олег Витальевич. Разработка и испытание живой сухой вакцины против эпизоотической диареи свиней (вакцина ВЕРРЕС-ЭДС) в экспериментальных и производственных условиях: диссертация . доктора биологических наук: 06.02.02 / Сергеев Олег Витальевич;[Место защиты: ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и станд артизации лекарственных средств для животных и кормов»].- Москва, 2014.- 140 с.

1. Обзор литературы: эпизоотическая диарея свиней

1.1. Общая характеристика и распространённость 5

1.2.1. Вирусные гастроэнтериты свиней .7

1.2.2. Систематика вируса ЭДС .10

1.2.4. Физико-химические свойства .10

1.2.6. Неструктурный белок ORF3 13

1.2.8. Антигенное родство 14

1.4. Эпизоотологические данные .17

1.6. Клинические признаки .21

1.8. Предупреждение и контроль .25

1.8.2. Специфическая иммунопрофилактика 25

1.9. Заключение по обзору литературы .29

1.10. Цель и задачи исследования 33

2. Собственные исследования

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Культуральные свойства и aттeнуация полевого изолята вируса ЭДС с целью получения вакцинного штамма .49

2.2.1.1. Серийное пассирование вируса в культуре клеток Vero и оценка его аттенуации 49

2.2.1.2. Антигенность штамма ИС в зависимости от длительности аттенуации вируса 52

2.2.1.3. Изменения в геноме штамма ИС вируса ЭДС как результат адаптации к культуре клеток Vero .54

2.2.2. Оптимизация условий массового культивирования вируса. 56

2.2.2.1. Состояние культуры клеток .56

2.2.2.2. Зависимость накопления вируса от дозы заражения 58

2.2.2.3. Культивирование вируса ЭДС в роллерных и статических условиях 59

2.2.2.4. Размножение штамма ИС в других линях клеток и в сублиниях клеток Vero 59

2.2.3. Разработка технологии изготовления и контроля живой сухой вакцины в экспериментальных условиях 62

2.2.3.1. Изготовление сухой вакцины 63

2.2.3.2. Контроль вакцины на безопасность и реактогенность .70

2.2.4. Разработка способа применения живой вакцины против ЭДС. 71

2.2.4.1. Способ введения вакцины 71

2.2.4.2. Антигенность штамма ИС в зависимости от прививочной дозы 74

2.2.4.3. Антигенность штамма ИС в зависимости от кратности введения и дозы вакцины .75

2.2.4.4. Применение экспериментальной серии сухой вакцины в неблагополучном по ЭДС хозяйстве .78

2.2.5. Изготовление и применение живой сухой вакцины ИС-ЭДС в хозяйствах, неблагополучных по ЭДС 81

2.2.5.1. Изготовление и контроль живой сухой вакцины в производственных условиях 81

2.2.5.2. Распространение ЭДС в крупных свиноводческих хозяйствах России 82

2.2.5.3. Вакцинопрофилактика ЭДС в производственных условиях .83

2.2.5.4. Сравнительная эффективность двух вариантов живой вакцины против ЭДС 90

2.2.6. Одновременная и последовательная вакцинация свиней против ЭДС и ТГС .92

2.2.6.1. Антигенность моновалентных живых вакцин 94

2.2.6.2. Антигенность бивалентной живой вакцины (ЭДС+ТГС) 94

2.2.6.3. Одновременное введение вакцин ИС-ЭДС и ТР-1 95

2.2.6.4. Последовательная вакцинация супоросных свиноматок против ТГС и ЭДС 96

3. Обсуждение результатов исследования 98

4. Выводы и практические предложения 118

1.1. Актуальность темы

Эпизоотическая диарея свиней (ЭДС) является высококонтагиозным вирусным заболеванием свиней, характеризующимся изнурительной диареей и дегидратацией организма. Заболеванию подвержены свиньи всех возрастов, но наиболее восприимчивыми являются новорождённые поросята до двухнедельного возраста, смертность среди которых колеблется в пределах 30-100%. ЭДС по клиническим признакам, патологоанатомической картине и эпизоотологии очень сходна с трансмиссивным гастроэнтеритом свиней (ТГС). Фактически ТГС и ЭДС – заболевания-двойники, вызываемые двумя кишечными коронавирусами свиней, не имеющими антигенного родства. Оба заболевания характеризуются высокой заболеваемостью и смертностью новорождённых поросят. Главными отличиями ЭДС являются отсутствие рвоты и более низкая смертность новорождённых поросят, более тяжёлое течение болезни у свиней в период откорма, а также латентное инфицирование и более медленное распространение. Летальность среди свиней, начиная с послеотъёмного возраста, составляет обычно 1-3 %. ЭДС, как правило, возникает внезапно и после одной или нескольких вспышек часто приобретает стационарный (энзоотический) характер.

В России ЭДС впервые обнаружена в крупных свиноводческих хозяйствах в 2006 г. (НПО НАРВАК). В полевых условиях разные штаммы вируса ЭДС обладают различной вирулентностью. Штаммы вируса, циркулирующие в странах Азии, в целом характеризуются более высокой вирулентностью по сравнению со штаммами, циркулирующими в странах Европы [Sueyoshi et al., 1995; Song and Park, 2012]. Причина данной географической зависимости неясна. Существенные экономические потери, причиняемые ЭДС некоторым странам азиатского региона, явились основанием для интенсивного изучения заболевания и его возбудителя. Можно выделить следующие направления исследований по ЭДС, в которых достигнут наибольший прогресс: этиология, эпизоотология, иммунобиология, диагностика и специфическая профилактика. Результаты исследований в данных направлениях являются научной основой для разработки эффективных мер борьбы против ЭДС. Изучены иммунобиологические свойства вируса ЭДС, особенности его репродукции in vitro, строение вириона и вирусного генома.

Центральным звеном в научном и практическом отношении явилась разработка метода культивирования вируса ЭДС вне организма. Решение этой важной и трудной задачи обеспечило возможность его выделения и изучения, а также разработки и изготовления диагностических и вакцинных препаратов. Размножение вируса ЭДС в культуре клеток позволило лишить его вирулентности при сохранении защитных свойств, а также обеспечило возможность оценивать его биологическую и антигенную активность, что определило успех при разработке средств специфической защиты. Размножение вируса ЭДС in vitro связано с необычным явлением в биологии вирусов. Линии клеток естественного хозяина – свиньи (СПЭВ, ПП, РК-15 и др.), высокочувствительные к вирусу ТГС, оказались нечувствительными к вирусу ЭДС. В то же время линия клеток Vero, произошедшая от естественно нечувствительного хозяина – обезьяны, оказалась чувствительной к вирусу ЭДС, но не к вирусу ТГС. При выделении полевого вируса ЭДС в культуре клеток Vero после нескольких пассажей его репликация сопровождается выраженным ЦПЭ. Однако в этой уникальной по чувствительности к вирусу ЭДС культуре клеток он накапливается в невысоком титре не выше 6,0 – 7,0 lg ТЦД50 /мл даже после продолжительной адаптации [Song et al., 2003]. Серийное пассирование вирулентных штаммов вируса ЭДС в культуре клеток быстро приводит к снижению и потере вирулентности и получению аттенуированных вакцинных штаммов [Kweon et al., 1999]. Молекулярной основой аттенуации вируса ЭДС и её необратимости при серийном размножении в культуре клеток считается делеция в последовательности вспомогательного гена ORF3.

Многие вопросы эпизоотологии ЭДС остаются невыясненными, в частности, частота латентного инфицирования и носительство вируса ЭДС различными технологическими и возрастными группами свиней. Известно, что в хозяйствах при ЭДС острая инфекция чаще, чем при ТГС переходит в хроническую форму [Pensaert and Yeo, 2006]. В качестве возможного объяснения этому и другим особенностям ЭДС можно считать тропизм вируса in vivo — предпочтительное размножение вируса ЭДС в энтероцитах крипт тонкого кишечника свиней.

Предварительный диагноз ТГС/ЭДС ставят на основании клинических признаков, патологоанатомических изменений и эпизоотологических данных. Окончательный (этиологический) диагноз устанавливают на основании результатов лабораторных исследований. Лабораторная диагностика включает обнаружение вирусного антигена или вирусной нуклеиновой кислоты и специфических антител. Серологические методы, помимо диагностического значения, представляют ценность для оценки иммунитета в практических условиях. Наиболее чувствительным и специфическим методом дифференциальной диагностики ТГС/ЭДС является гнездовая (дуплексная) версию ПЦР [Kim et al., 2000, 2001]. Для дифференциации вирусов ЭДС и ТГС в практических условиях удобным оказался метод иммунохроматографии на стрипах [Kang et al., 2007].

Специфическая профилактика ЭДС представляет собой актуальную проблему для ряда стран с развитым свиноводством. Как и в случае ТГС, основу стратегии специфической профилактики ЭДС составляет пассивный лактогенный иммунитет, то есть иммунизация супоросных свиноматок и защита потомства антителами молозива и молока [Saif, Wesley, 1999]. Основным медиатором лактогенного иммунитета служит иммуноглобулин IgA, который нейтрализует вирус на поверхности слизистой оболочки и предупреждает развитие инфекции [Stokes, Waly, 2006]. Роль клеточного иммунитета в защите свиней от ЭДС не изучена [Song, Park, 2012].

Для специфической профилактики ЭДС в разных странах применяют различные живые вакцины из культуральных аттенуированных штаммов вируса ЭДС. Создание инактивированной вакцины против ЭДС представляется экономически невыгодным направлением. Живые вакцины вводят супоросным свиноматкам, как правило, внутримышечно, хотя одна группа авторов показала, что оральное введение вакцины приводит к более выраженному иммунитету у свиноматок и лучшей защите потомства от инфекции по сравнению с внутримышечным введением [Song et al., 2007]. Однако оральное введение неприемлемо при массовой вакцинации в условиях крупных свиноводческих хозяйств. Существуют опасения некоторых исследователей, что напряжённость иммунитета, индуцированного некоторыми коммерческими живыми вакцинами, часто недостаточна, так как после вакцинации свиноматок вирус ЭДС выделяется с фекалиями у экспериментально зараженных поросят примерно так же, как у серонегативных поросят контрольной группы [Yuan et al., 1998]. Однако главным критерием практической ценности живых вакцин против ЭДС является их безопасность и эпизоотическая эффективность, которая тесно коррелирует с уровнем лактогенного иммунитета (титр ВНА в молозиве и молоке) у вакцинированных свиноматок.

1.2. Цель и задачи исследования

Целью исследования являлась разработка эффективной живой вакцины против ЭДС и условий её применения в ветеринарной практике.

В задачи исследования входило:

Получить вакцинный культуральный штамм вируса ЭДС и изучить его антигенные (иммуногенные) свойства;

Определить генетическую основу аттенуации вируса ЭДС;

Оптимизировать условия размножения вакцинного штамма вируса ЭДС в перевиваемой культуре клеток;

Разработать условия изготовления и контроля живой сухой вакцины и режим её хранения;

Определить оптимальную схему вакцинации свиней в практических условиях;

Изготовить экспериментальные серии вакцины и испытать их эффективность в лабораторных и производственных условиях;

Изготовить производственные серии вакцины и испытать их в неблагополучных по ЭДС хозяйствах;

Изучить возможность одновременной иммунизации свиней против ЭДС и ТГС;

Составить и утвердить нормативную документацию на живую сухую вакцину против ЭДС в установленном порядке.

1.3. Научная новизна работы

Выявлено существенное различие между «вирусами-близнецами» ЭДС и ТГС при культивировании in vitro. Различие заключалось в том, что полевой вирус ЭДС вопреки общеизвестной закономерности не размножался в культуре клеток естественного хозяина – свиньи (линии клеток СПЭВ, ППС, РК-15), но размножался в культуре клеток нечувствительного вида – зелёной мартышки (линия клеток Vero). Вирус ЭДС размножался in vitro мене интенсивно, чем вирус ТГС. В культуре клеток Vero он накапливался незначительно даже после 40 пассажей (10 4,0 – 10 5,0 ТЦД50 / мл), что исключало возможность его использования для изготовления инактивированной вакцины. В результате пассирования полевого вирулентного вируса ЭДС в культуре клеток Vero получен авирулентный штамм ИС, отвечающий требованиям, предъявляемым к штаммам для изготовления живых вакцин. Вирулентность полевого вируса ЭДС исчезла относительно быстро (после 26 – 28 пассажей в культуре клеток Vero) и связана с делецией в гене ORF3. Длительное пассирование аттенуированного штамма ИС в культуре клеток Vero (110 пассажей) сопровождалось лишь незначительным повышением его инфекционности (10 5,0 – 10 6,3 ТЦД50 / мл) при сохранении антигенности. При аттенуации различных вирусов такое явление наблюдается редко и свидетельствует о необычной стабильности антигенных свойств штамма ИС вируса ЭДС при длительной репликации in vitro.

Определены условия удовлетворительного накопления вакцинного штамма ИС в культуре клеток Vero. Различные изменения условий культивирования не привели к повышению его репликации.

Ревакцинация свиней сопровождалась повышением иммунного ответа. Наилучшие результаты получены при двукратном внутримышечном введении вакцины ИС в дозе 10 4,0 ТЦД50 с интервалом 15-20 дней.

Одновременное введение инактивированной вакцины против ТГС и живой вакцины против ЭДС сопровождалось подавлением иммунного ответа против обоих заболеваний. Последовательное введение указанных вакцин супоросным свиноматкам с интервалом 21 день приводило к образованию выраженного иммунитета против каждого заболевания.

В период вспышки ЭДС (2008-2010 гг.) выявлены некоторые особенности течения болезни. В отдельных свиноводческих комплексах отмечена высокая заболеваемость свиней в период доращивания (>60%) и в период откорма (>90%), а также спонтанная латентная иммунизация свиноматок полевым вирусом и, как следствие, низкая заболеваемость поросят (около 20%) в возрасте до 2 недель.

1.4. Практическая значимость работы

На основании результатов исследований, представленных в диссертационной работе, впервые в России разработана и внедрена в ветеринарную практику сухая живая вакцина против эпизоотической диареи свиней (вакцина ВЕРРЕС-ЭДС) и определены условия её практического применения. Доказана безопасность и высокая эпизоотическая эффективность применения вакцины в промышленном свиноводстве. Разработаны и внедрены СТО на производственное изготовление сухой живой вакцины против ЭДС и инструкция по её применению. Вакцина ВЕРРЕС-ЭДС против эпизоотической диареи свиней используется в ветеринарной практике с 2008 года. Изготовление и применение вакцины проводится в соответствии с нормативной документацией, утверждённой и зарегистрированной в установленном порядке.

1.5. Личное участие автора

Экспериментальные исследования были выполнены автором лично либо при его непосредственном участии в коллективных работах. Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в постановке целей и задач, планировании и проведении экспериментов и интерпретации полученных результатов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

1.6. Апробация

Основные положения диссертации опубликованы, доложены и одобрены на: заседаниях Учёного совета ООО Ветбиохим в 2008 – 2010 гг., заседаниях Учёного совета ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России, XVII Московском международном ветеринарном конгрессе (2009), V Международном конгрессе по вакцинам (Сиэтл, США, 2011).

1.7. Публикация результатов исследования

По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 11 — в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, в том числе 1 патент.

1.8. Объём и структура работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и практических предложений, списка литературных источников и приложений. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, включает 31 таблицу, 7 рисунков, 184 источника литературы.

1.8. Основные положения, выносимые на защиту

1. Выбор культуры клеток для размножения вируса ЭДС с целью изготовления вакцины

2. Получение вакцинного штамма ИС вируса ЭДС в результате пассирования в культуре
клеток

3. Оптимизация условий размножения вакцинного штамма ИС in vitro

4. Антигенность (иммуногенность) вакцинного штамма ИС при длительном пассировании в

5. Разработка живой сухой вакцины из аттенуированного штамма ИС

6. Изготовление и контроль живой сухой вакцины против ЭДС в лабораторных

и производственных условиях

7. Разработка оптимальной схемы применения живой сухой вакцины против ЭДС

8. Результаты применения живой сухой вакцины против ЭДС в производственных условиях

Читайте также:  Диарея при которой госпитализируют

Патологию желудочно-кишечного тракта свиней вызывают вирусы пяти семейств: Coronaviridae, Reoviridae, Caliciviridae, Astroviridae и Adenoviridae. Однако, несмотря на это многообразие, ведущая роль в этиологии массовых острых гастроэнтеритов свиней и особенно поросят в неонатальный период развития принадлежит коронавирусам. По экономическому ущербу, причиняемому промышленному свиноводству, особое значение имеют коронавирусные гастроэнтериты: трансмиссивный гастроэнтерит свиней (ТГС) и эпизоотическая диарея свиней (ЭДС) [3, 10, 11, 19]. ТГС и ЭДС – два массовых вирусных диарейных заболевания свиней, очень сходные по характеру течения, клиническим проявлениям, патологоанатомической картине и патоморфологическим изменениям. Много общего имеет их эпизоотология. Фактически ТГС и ЭДС – заболевания-двойники, вызываемые двумя кишечными коронавирусами свиней, не имеющими антигенного родства. Оба заболевания характеризуются высокой заболеваемостью и смертностью новорожденных поросят. Поскольку поросята заболевают и гибнут в первые дни жизни, возможность их активной иммунизации исключается.

Вирус ТГС является более патогенным по сравнению с вирусом ЭДС. Он вызывает гибель 80-100% поросят до 10-дневного возраста. Более выраженная патогенность вируса ТГС обусловлена более масштабным разрушением энтероцитов от основания до вершины ворсинок тонкого кишечника (рис. 1А). Инфицированные энтероциты разрушаются и слущиваются в просвет кишечника, ворсинки быстро атрофируются. В первые сутки после заражения резко нарушается пищеварение и всасывание и развивается диарея, следствием которой является тяжелая дегидратация. Потеря воды с фекалиями у поросят в первые дни после рождения достигает 150 мл в сутки. У поросят 3-недельного возраста энтероциты поражаются только в отдельных участках тощей и подвздошной кишок [10].

Вирус ЭДС размножается в энтероцитах нижней части ворсинок и крипт (рис. 1 Б). По-видимому, по этой причине вирус ЭДС вызывает менее интенсивную диарею и меньшую смертность по сравнению с вирусом ТГС, но по той же причине может длительно персистировать в кишечнике животных [122, 126]. 1.2.2. Систематика вируса ЭДС

Возбудителем ЭДС является РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Соronaviridае (порядок Nidovirales). На основе антигенных и генетических критериев вирус ЭДС вместе с коронавирусами человека NL63 и 229 Е и несколькими коронавирусами летучих мышей принадлежат роду Alphacоronavirus (до недавнего времени антигенная группа 1) [67, 142]. В данный род также входит недавно установленный вид альфакоронавирус 1, который включает вирусы, недавно считавшиеся самостоятельными видами: вирус ТГС, коронавирус собак, коронавирусы кошек типов I, II и вирус инфекционного перитонита кошек [49].

Вирионы вируса ЭДС обладают всеми характеристиками семейства Соronaviridае [35, 124]. Они представляют собой плеоморфные частицы диаметром 95-190 (в среднем 130) нм (Рис. 2 А). Они состоят из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки, на поверхности которой имеются характерные радиальные булавовидные пепломеры (выступы) длиной 18-23 нм, формирующие «корону» [55, 160].

Плавучая плотность вирионов вируса ЭДС в градиенте сахарозы равна 1,18 г/см3. Адаптированный к культуре клеток вирус ЭДС теряет инфекционность при 600С в течение 30 мин, но сохраняет стабильность при 500С. При 40С вирус стабилен при рН 4,0 — 9,0, при 370С он стабилен при рН 6,5-7,5 [28, 98]. Вирус ЭДС является чувствительным к эфиру, хлороформу и другим жирорастворителям, детергентам и ультрафиолетовым лучам, быстро инактивируется формалином (0,03%). 1.2.5. Структурные белки В вирионах вируса ЭДС обнаружено 4 белка. В состав липопротеидной оболочки вирионов входят поверхностный (пепломерный) гликопротеин S, формирующий выступы, большой мембранный гликопротеин М и негликозилированный белок оболочки Е. С вирусной РНК ассоциирован негликозилированный белок N, вместе они формируют спиральный нуклеокапсид (рис. 2 Б) [110, 131].

Белок S является гликопротеином типа I. Он состоит из 1 383 аминокислотных остатков (штамм CV777) и имеет молекулярную массу 150-220 кД (различных штаммах вируса). Гликопротеин S отвечает за адсорбцию вирионов на энтероцитах кишечника посредством связывания вириона с клеточными рецепторами и за слияние липопротеидной оболочки вируса с плазматической мембраной клетки [51, 135, 162]. Для вируса ЭДС выявлена связь между белком S, адаптацией вируса к размножению в культуре клеток и вирулентностью [118, 144]. Гликопротеин S также обусловливает гемагглютинирующую активность вируса ТГС, однако вирус ЭДС гемагглютинирующей активностью не обладает [28]. Гликопротеин S индуцирует синтез вируснейтрализующих антител (ВНА), в его составе идентифицированы четыре вируснейтрализующих эпитопа [34, 42, 65, 78, 161].

Белок М (20-30 кД) является наиболее многокопийным компонентом вирионной оболочки. Он представляет собой структурный мембранный гликопротеин, трижды пронизывающий мембрану, с коротким N-концевым доменом на поверхности вириона и долгим С-концевым доменом внутри [79, 168]. Показано, что гликопротеин М играет важную роль в процессе сборки вирионов [113, 134], в чём не исключено также участие белка Е (7 кД) [22]. Гликопротеин М индуцирует синтез антител, способных нейтрализовать вирус в присутствии комплемента [135], и, возможно, альфа интерферона [97].

Полевой вирус эпизоотической диареи свиней (ЭДС) был передан в ЗАО НПО НАРВАК в виде культуральной жидкости. Данный вирус был выделен в культуре клеток Vero из кишечника больного поросёнка и к моменту передачи прошёл шесть серийных пассажей в культуре клеток Vero. 2.2.1.1. Серийное пассирование вируса в культуре клеток Vero и оценка его аттенуации Прежде всего, предстояло выяснить культуральные и вирулентные свойства полученного вируса. Выявление спектра чувствительных линий клеток естественного хозяина представляло интерес с целью выбора наиболее пригодного клеточного субстрата для исследовательских и производственных целей. На первом этапе исследовали чувствительность линий клеток СПЭВ и ППК, используемых в работе с вирусом ТГС. В отличие от линии клеток Vero, обе линии клеток оказались нечувствительными к вирусу ЭДС. Поэтому для дальнейших исследований и прежде всего для аттенуации вируса ЭДС использовали линию клеток Vero.

В процессе решения различных задач вирус ЭДС прошёл более 100 серийных пассажей в культуре клеток Vero. Размножение вируса постоянно сопровождалось характерным ЦПЭ, который выражался в интенсивном формировании вакуолизированных синцитиев, сливающихся в симпласты (рис. 6). По мере пассирования период наступления выраженного ЦПЭ постепенно сокращался, а накопление вируса постепенно повышалось. Так, в течение первых 20 пассажей вирус накапливался в титре 3,0-3,5 lg ТЦД50/мл, а после 40 пассажей титр вируса был в пределах 4,0-5,0 lg ТЦД50/мл.

Результаты проведенных исследований (таблица 1) показали, что время наступления цитопатического эффекта и накопления вируса зависели от длительности пассирования и множественности заражения культуры клеток Vero. После 80 пассажей вирус накапливался максимально в титре 5,50 – 6,50 lg ТЦД50/мл.

Начиная с 40 пассажа, вирус периодически использовали для изготовления экспериментальных образцов живой вакцины.

С целью аттенуации полевой вирус серийно пассировали в культуре клеток Vero. Вирулентность культурального вируса ЭДС на уровне 15, 26 и 30 пассажей в культуре клеток Vero изучали в опытах на 2-3-дневных безмолозивных поросятах, полученных от свиноматок, серонегативных к вирусам ЭДС и ТГС. Культуральную вируссодержащую жидкость поросятам вводили орально в объёме 2 мл. Доза вируса составляла 3,33 lg ТЦД50 (15 пассаж) и 3,66 lg ТЦД50 (26 и 30 пассажи). Каждый вариант вируса вводили двум поросятам. В течение опыта (7 дней) поросят содержали при температуре 25-270С и в течение первых суток после заражения кормили стерилизованным коровьим молоком через соску каждые 4-6 часов. Вирус 15 пассажа вызвал слабовыраженную диарею через 16 часов после введения, которая прекратилась через 48 часов. У поросят, которым ввели вирус 26 пассажа, отклонений от нормального состояния не отмечали в течение всего периода наблюдения. Безмолозивные поросята, которым ввели вирус 30 пассажа, оставались нормальными в течение всего периода наблюдения (7 дней).

Из результатов этого опыта следует, что после 25-30 серийных пассажей в культуре клеток Vero вирус ЭДС полностью утратил вирулентность для новорождённых поросят.

Авирулентный штамм вируса ЭДС получил название ИС (по названию страны первичного выделения вирулентного вируса — Испания). Штамм ИС депонировали в коллекцию вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского (удостоверение ГКВ 2467 от 08.10.2009). В дальнейшем его использовали в исследовательских целях и разработке живой вакцины.

Антигенные свойства штамма ИС, аттенуированного в культуре клеток

Vero, определяли на серонегативных к вирусу ЭДС поросятах послеотъёмного возраста (35-40 дней). Поросят иммунизировали внутримышечно, однократно. Через 21 день после введения вируса определяли титр ВНА в сыворотке крови.

В первом опыте вирус, прошедший 40 пассажей в культуре клеток Vero, вводили в дозе 4,0 и 5,0 lg ТЦД50. Введение вируса вызывало образование ВНА в титре 1:32 – 1:40 и 1:60 – 1:80 соответственно дозе инокуляции. Данные этого опыта показали антигенность вакцинного штамма вируса ЭДС для свиней, степень которой зависит от дозы вакцины.

В следующем опыте с целью определения возможного диапазона пассирования вакцинного штамма ИС без снижения его антигенной активности исследовали вирус 40, 60 и 80 пассажей в культуре клеток Vero. Вирусом одного уровня пассажа прививали группу 35-40-дневных поросят, которых в соответствии с технологией в период доращивания содержали в одном секторе (53-71 голов). Доза иммунизации составляла 4,0 lg ТЦД50. Титр ВНА в сыворотке крови определяли у 5 поросят из каждого сектора.

Результаты исследования показали, что штамм ИС, прошедший 40, 60 и 80 пассажей в культуре клеток Vero, не различается по антигенной активности для свиней. Поросята, иммунизированные вирусом всех трёх уровней пассажа, развили антительный ответ сходной интенсивности. Титр ВНА составлял 1:30 – 1:40 (таблица 2).

Первую пробную серию сухой вакцины, изготовленную в конце 2008 г., применили в начале 2009 г. с целью испытания в неблагополучном по ЭДС хозяйстве СПК «Агрофирма Красная Звезда» Вологодской области. Результаты применения данной серии вакцины имели прототипное значение для дальнейшего массового изготовления и применения вакцины в неблагополучных по ЭДС хозяйствах. Экспериментальная серия сухой вакцины, приготовленная из вируса 40-45 пассажа в культуре клеток Vero, имела активность 4,0 lg ТЦД50 /мл. Свиней прививали двукратно с интервалом 15 дней в объёме 2 мл. Супоросных свиноматок и ремонтных свинок прививали на 75-80 и 90-95 дни супоросности (примерно за 40 и 25 дней до опороса). Кроме того, прививали двукратно поросят в возрасте 30-35 дней. Специфическую сероконверсию, обусловленную вакцинацией, оценивали по титру ВНА в сыворотке крови привитых животных (таблица 20) и в молозиве свиноматок через сутки после опороса (таблица 21), а также в крови поросят через 2, 4, 7 и 15 дней после рождения (таблица 22). Результаты исследования, приведённые в таблице 20, показали, что сухая вакцина в дозе 4,0 lg ТЦД50 /мл вызывала выраженную сероконверсию у всех трёх групп свиней, особенно после двукратного применения. Кроме того, вакцинация поросят в послеотъёмный период показала возможность их использования при оценке вакцины в зависимости от дозы и схемы вакцинации. В данном неблагополучном по ЭДС хозяйстве специфическая серопозитивность перед вакцинацией была наиболее выраженной у основных свиноматок, по-видимому, за счёт предшествовавшего латентного инфицирования полевым вирусом (одна из характерных особенностей течения ЭДС в полевых условиях).

Исследование колострального иммунитета у двукратно вакцинированных свиней показало наличие в молозиве в день опороса специфических ВНА в высоком титре. У основных свиноматок – 1:120 –1:320, у ремонтных свинок – 1:120 – 1:240 (таблица 21).

Анализ динамики колостральных антител в сыворотке крови поросят в течение первых 15 дней жизни (таблица 22) показал постепенное снижение концентрации ВНА более чем в 3 раза (с 1:190 до 1:60). Исходя из этих данных можно заключить, что период полужизни колостральных антител против вируса ЭДС составляет около 7 дней.

В неблагополучных по ЭДС хозяйствах применяли три разработанные в НПО НАРВАК варианта вакцины против ЭДС: инактивированную «кишечную», живую замороженную и живую сухую. При изготовлении производственных серий сухой вакцины использовали технологию, разработанную для изготовления экспериментальных серий сухой вакцины (раздел 2.2.3.1). В 2010-2011 гг изготовлено восемь серий сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС. Лиофилизацию вакцины проводили в аппарате Christ Epsilon. Использовали вирус, прошедший 60 — 100 пассажей в культуре клеток Vero, с титром инфекционной активности 5,50 — 6,33 lg ТЦД50 / мл. Перед лиофилизацией смесь вируссодержащей жидкости с защитной средой расфасовывали по 1 мл в 3 см3 флаконы, как описано в разделе Материалы и методы. Количество флаконов с вакциной в одной серии значительно различалось, от 1500 до 30 000. После определения активности вируса в сухой вакцине рассчитывали число прививочных доз вакцины в единице фасовки (1 мл во флаконе), исходя из значения 4,00 lg ТЦД50 для одной Из данных, представленных в таблице 23, видна прямая зависимость снижения титра инфекционной активности вируса с увеличением объёма серии сухой вакцины. Так, например, при лиофилизации вакцины объёмом 1,2 – 2,3 л (серии 1-3) потеря инфекционности вируса составила 0,66 lg ТЦД50 / мл, тогда как при лиофилизации вакцины объёмом 12 – 21,5 л (серии 4-8) потеря инфекционности составила 0,83 – 1,00 lg ТЦД50 / мл. Однако следует отметить, что указанное различие не выявлялось при испытании серий вакцины методом ускоренного старения.

Приведённые выше данные показали, что при одновременном применении вакцины против ТГС (инактивированная вакцина ТР-1) и ЭДС (живая вакцина ВЕРРЕС-ЭДС) защитный эффект вакцинации против ТГС может быть значительно снижен. Кроме того, возникают технические неудобства (введение вакцин с двух сторон шеи), Поэтому представлялось целесообразным изучить эффективность последовательной вакцинации супоросных свиноматок против ТГС и ЭДС. В опыте использовали две группы по 7 супоросных свиноматок. Одну группу супоросных свиноматок (группа 1) вакцинировали вначале против ТГС (вакцина ТР-1), а спустя 21-30 дней – против ЭДС (вакцина ВЕРРЕС-ЭДС). Другую группу супоросных свиноматок (группа 2) вакцинировали вначале против ЭДС, а спустя 21-30 дней – против ТГС. В каждой группе вакцинировали по 7 серонегативных свиноматок. Кровь для определения титра ВНА у свиноматок обеих групп брали дважды через 21 день после введения первой вакцины и через 21 день после введения второй вакцины. Результаты этого опыта (таблица 31) показали, что при последовательной вакцинации супоросных свиноматок против ТГС (вакцина ТР-1), а затем против ЭДС (вакцина ВЕРРЕС-ЭДС) и наоборот с интервалом между вакцинациями 21 день антигенность указанных вакцин не снижается. Для гуморального иммунитета не имеет существенного значения, какую из двух вакцин применяли сначала, а какую — потом. Такая схема вакцинации удобна для практического применения против обоих заболеваний и может быть использована в случае необходимости.

Вакцинопрофилактика по праву считается одним из выдающихся достижений биологической науки, характерной чертой развития которой является быстрое использование достижений в других областях науки. Благодаря этому достигнуты большие успехи в борьбе со многими опасными инфекционными заболеваниями человека и животных. Например, с помощью глобальной вакцинопрофилактики в мире искоренена натуральная оспа человека (1979 г.), создан эффективный контроль других опасных заболеваний человека, таких как полиомиелит, грипп, корь, бешенство и другие.

Значительный успех достигнут в ликвидации и профилактике многих глобальных вирусных болезней животных (ящур, классическая чума свиней, чума жвачных, ньюкаслская болезнь птиц и др.).

Специфическая профилактика многих инфекционных болезней сельскохозяйственных животных достигла исключительно широких масштабов и стала неотъемлемой частью технологии промышленного животноводства развитых стран. Изготовление некоторых вакцин исчисляется миллионами и миллиардами доз. Центральным звеном разработки и производства современных вирусных вакцин является размножение вирусов в культуре клеток.

Размножение вирусов млекопитающих и птиц in vitro стало основным методом вирусологии, особенно при изготовлении средств специфической профилактики. За небольшим исключением (калицивирусы, торовирусы, вирусы папилломы человека, геморрагической болезни кроликов, гепатита Е), вирусы человека и животных успешно выращивают in vitro. Оказалось, что разные вирусы значительно различаются по спектру чувствительности культур клеток, способных поддерживать их репликацию. Одни вирусы размножаются в клетках многих типов первичных культур и линий, другие – только в клетках некоторых линий. Например, представители семейств пикорнавирусов и парвовирусов как правило реплицируются в культурах клеток натуральных хозяев, тогда как рабдовирусы обладают широким хозяинным спектром in vitro. Представители семейства парамиксовирусоув значительно различаются между собой по широте хозяинного спектра in vitro. Вообще спектр чувствительных культур клеток к данному вирусу предсказать невозможно. Наиболее чувствительный клеточный субстрат устанавливают экспериментальным путём или на основе данных литературы.

Выбор наиболее продуктивной культуры клеток для данного вируса часто является непростой задачей. Даже при размножении в наиболее чувствительной культуре разные вирусы существенно различаются по уровню накопления, особенно инфекционного вируса. Например, полиовирус и вирус ящура в элективных культурах клеток накапливаются в высоком титре (107 – 109 ТЦД50/мл). Вирус везикулярного стоматита обладает широким хозяинным спектром in vitro и высоким накоплением [9]. Оказалось, что клетки естественно восприимчивого вида, не являясь клетками-мишенями in vivo, могут приобрести высокую чувствительность к вирусу после размножения в культуре клеток. Например, размножение нейротропного вируса полиомиелита в культуре клеток почки приматов стало открытием, положившим начало новому направлению в вирусологии. Другим примером является эпителиотропный вирус ящура, который прекрасно размножался в культуре клеток почки телят. Можно привести множество подобных примеров, которые свидетельствуют об изменении рецепторного аппарата клеток в результате их эксплантации и размножения in vitro.

Уровень накопления вируса в культуре клеток позволяет сделать важный выбор в пользу изготовления живой или инактивированной вакцины. При низком накоплении вируса остаётся возможность изготовления только живой вакцины. Возможность крупномасштабного изготовления культуральных инактивированных вакцин против полиомиелита и ящура является счастливым исключением и венцом биотехнологии 20-го века. Вирус для первой вакцины размножают в первичной культуре (субкультуре) клеток почки обезьян, для второй – в культуре клеток почки сирийского хомяка (в реакторах большой ёмкости 1000 л). Особенно важная роль культурам клеток принадлежит в разработке и производстве средств специфической профилактики вирусных заболеваний человека и животных. За небольшим исключением, вирусы человека и животных размножают in vitro. Однако они значительно различаются между собой по спектру чувствительных культур клеток и интенсивности репликации. Одни вирусы обладают широким спектром чувствительных культур клеток, другие – узким. Например, представители семейств пикорнавирусов и парвовирусов, как правило, реплицируются в культурах клеток естественных хозяев, тогда как рабдовирусы обладают более широким спектром чувствительных клеток независимо от их происхождения. Представители одного и того же семейства вирусов могут значительно различаются между собой по широте хозяинного спектра клеточных культур. Как правило, чувствительными к каждому конкретному вирусу оказываются культуры клеток (первичные, субкультуры, перевиваемые линии), происходящие от естественно восприимчивого вида.

источник

Понравилась статья? Поделить с друзьями: